詳解非洲豬瘟PCR儀檢測方法
更新時間：2021-11-11 點擊次數(shù)：7856
采集豬的脾臟、淋巴結(jié)、血液等組織材料或血粉用于檢測，樣品應(yīng)在冷藏條件下盡快運輸至實驗室，避免反復(fù)凍融。采樣時應(yīng)穿戴個人生物安全防護裝備，實施現(xiàn)場消毒和廢棄物處理。檢測前樣品應(yīng)在二級生物安全柜中處理。取0.1g~0.2g組織或血粉，經(jīng)研磨破碎后加1l的0.01mol/LPBS（pH7.2）制成勻漿，經(jīng)10000r/min離心取上清；全血、血清樣品直接取1mL，置于1.5皿離心管內(nèi)蓋緊管帽。將上述處理的樣品置于60℃條件下滅活30min。
非洲豬瘟PCR儀病毒DNA提取方式：
1、DNA提取應(yīng)在樣本制備區(qū)內(nèi)采用以下方法進行，若使用其他等效的病毒DNA提取試劑，則按照試劑說明書操作。
2、待檢樣品、陽性對照和陰性對照的份數(shù)總和用n表示，取n個滅菌1.5l離心管，逐管編號。
3、每管加入200uLDNA提取液1，然后分別加入待測樣品、陰性對照和陽性對照各200uL，1份樣品換用1個吸頭，混勻器上震蕩混勻5s。于4℃~25℃條件下，13000r/min離心10min。
4、盡可能吸取上清、棄去，吸頭不要碰到沉淀，再加入10uLDNA提取液2，混勻器上震蕩混勻5s。于4℃~25℃條件下，2000r/min離心10s。
5、100℃干浴或沸水浴10min。
6、加入90uL無DNA酶的滅菌去離子水，13000r/min離心10min，上清即為提取的DNA，-20℃保存?zhèn)溆谩?/div>
非洲豬瘟PCR儀操作步驟：
1、在反應(yīng)混合物配制區(qū)、樣品制備區(qū)和檢測區(qū)分別進行提取。
2、每個檢測反應(yīng)體系需使用20uL實時熒光PCR反應(yīng)液。充分混勻后分裝，每個PCR反應(yīng)管20uL。轉(zhuǎn)移PCR反應(yīng)管至樣品制備區(qū)。
3、反應(yīng)管中分別加入提取的DNA溶液5L，使每管總體積達到25L，記錄反應(yīng)管對應(yīng)的樣品編號。蓋緊管蓋后，瞬時離心。
4、將加樣后的反應(yīng)管放入實時熒光PCR檢測儀內(nèi)，記錄反應(yīng)管擺放順序。選定5-羧基熒光素（FAM）作為報告基團，小溝結(jié)合物（MGB）為淬滅基團，反應(yīng)參數(shù)設(shè)置如下：預(yù)變性95℃/3 min；95℃/15s，52℃/10s，60℃/35s，45個循環(huán)；在每次循環(huán)的60℃退火延伸時收集熒光。試驗結(jié)束后，根據(jù)收集的Ct值和熒光曲線判定結(jié)果。
非洲豬瘟PCR儀檢測閥值設(shè)定原則：閥值線超過陰性對照擴增曲線的高點，且相交于陽性對照擴增曲線進入指數(shù)增長期的拐點，或根據(jù)儀器噪聲情況進行調(diào)整。每個樣品反應(yīng)管內(nèi)的熒光信號到達設(shè)定的域值時所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)即為Ct值。
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