实时荧光定量PCR仪主要由荧光定量系统和计算机组成。荧光定量系统负责监测PCR反应过程中的荧光信号，而计算机则负责收集、处理和分析这些荧光数据。数据通过开发的实时分析软件以图表的形式显示，原始数据被绘制成荧光强度相对于循环数的图表，便于后续的分析和解读。
 

　　其工作原理基于在PCR反应体系中加入荧光染料或荧光标记探针。这些荧光物质能够随着PCR反应的进行而发出荧光信号，其强度与扩增产物数量成正比。在PCR反应过程中，仪器通过荧光检测系统实时测量荧光信号强度，从而监测PCR扩增的进程。
 

　　具体来说，PCR反应包括变性、退火和延伸三个步骤。在变性步骤中，DNA双链被打开成单链；在退火步骤中，特异性引物与模板DNA的单链结合；在延伸步骤中，DNA聚合酶沿着引物延伸，合成新的DNA链。这三个步骤在PCR仪中通过准确控制温度来实现循环进行，每个循环扩增的产物量呈指数增长。
 

　　根据所用荧光物质的化学原理和PCR检测的特异性，可将实时荧光定量PCR仪分为两大类：DNA染料法和荧光探针法。
 

　　1.DNA染料法：如SYBR Green I等荧光染料可以快速渗入DNA双链与之结合，发射荧光信号，而不掺入双链的荧光染料分子不会发射任何荧光信号，可以对特异性和非特异性的PCR扩增产物进行检测。这种方法可检测所有双链DNA扩增产物，包括非特异反应产物，如引物二聚体，不需要探针，因此减少了实验设计及运转成本，适合于大量基因的分析，但缺点是易产生假阳性现象。
 

　　2.荧光探针法：可分为Taqman探针法和分子信标探针法。Taqman探针法是在PCR扩增时在加入一对引物的同时，再加入一个特异性的荧光探针，该探针两端分别标记一个报告荧光基团和一个淬灭荧光基团。当探针完整时，报告基团发出的荧光信号正好被淬灭基团吸收，体系中没有光信号；随着反应的进行，探针被Taq酶的5'-3外切酶酶切降解，使报告基团与淬灭基团分离，信号检测系统接收荧光信号。分子信标是种由于碱基互补形成的茎环结构的寡核苷酸，由于荧光基团与猝灭基团靠得很近，荧光被淬灭。PCR扩增过程中随着DNA双链解链，信标的茎环与暴露的DNA靶序列杂交，互补区被拉开致使荧光基团和泮灭基团之间距离增加，荧光恢复。