荧光定量PCR(qPCR)是一种在PCR反应体系中加入荧光基团，通过对PCR扩增反应中每一个循环产物荧光信号的实时检测，通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法，随着技术的不断发展和完善，它将在更多领域发挥重要作用。
 

　　荧光定量PCR的测定步骤：
 

　　1.实验准备：
 

　　-仪器检查：打开设备电源，检查是否正常启动；查看触摸屏、电脑连接等是否正常。
 

　　-样品准备：确保样品的质量良好，无杂质和污染，并根据实验需要适当稀释样品。
 

　　-引物设计：合理设计引物序列，确保其特异性和互补性，避免引物间的二聚体或非特异性扩增。
 

　　-反应体系准备：根据实验需要准备好反应体系，包括引物、模板DNA、荧光标记的探针和PCR反应缓冲液等。
 

　　2.设置PCR反应：
 

　　-选择适当的热循环参数：包括初始变性温度和时间、退火温度和时间以及延伸温度和时间。这些参数应根据具体的引物和模板特性进行优化。
 

　　-将反应体系加入PCR管或板中：并确保密封良好以避免污染和蒸发。
 

　　-将PCR管或板放入PCR仪中：并关闭盖子以确保温度均匀分布。
 

　　3.开始PCR反应：
 

　　-启动PCR程序：按照设定的热循环参数进行PCR反应。
 

　　-实时监测荧光信号：在每个循环结束时收集荧光信号强度。
 

　　4.数据分析：
 

　　-生成扩增曲线：通过将荧光强度与循环数作图生成扩增曲线。
 

　　-确定阈值循环数(Ct值)：Ct值是指扩增过程中荧光信号达到设定阈值时的循环数。
 

　　-计算相对表达量或绝对拷贝数：使用标准曲线法或比较\(2^{-\Delta\Delta Ct}\)法等方法对目标基因进行定量分析。