在PCR反应中，将待扩增的DNA模板、引物、四种脱氧核苷酸(dNTPs)和DNA聚合酶等成分加入96孔反应板的每个孔中，然后放入96孔PCR仪中，按照预设的程序，依次在高温下使DNA变性解链为单链，在较低温度下引物与模板DNA结合(退火)，再在适宜温度下DNA聚合酶催化引物延伸合成新的DNA链。经过多次循环，目标DNA片段的数量呈指数级增长。
 

　　除了常规PCR的基本原理外，实时荧光定量PCR仪在反应体系中加入了荧光基团。在PCR扩增过程中，荧光基团的信号强度与PCR产物的数量成正比。通过荧光检测系统实时监测荧光信号的变化，就可以对目标基因进行定量分析。
 

　　96孔PCR仪的测定步骤：
 

　　1.实验准备
 

　　-试剂与样品准备：准备好PCR反应所需的各种试剂，如DNA模板、引物、dNTPs、TaqDNA聚合酶等，并确保其质量和纯度符合实验要求。根据实验设计，准确计算和配制反应体系，可进行预实验以优化反应条件。
 

　　-器材准备：准备好干净的光学级封板膜、移液器及配套的吸头等。确保PCR板无划痕、无污染，封板膜密封性良好。
 

　　2.加样
 

　　-加样操作：将配制好的PCR反应体系依次加入96孔PCR板的各孔中，注意移液器的使用技巧，避免气泡产生，并确保每个孔中的样品和试剂量准确且一致。在加样过程中，要严格遵循无菌操作原则，避免交叉污染，每次更换样品或试剂时都要更换移液器的吸头。
 

　　-封板：加样完成后，用光学级封板膜将PCR板密封好，防止PCR过程中的蒸发和污染，确保每个孔中的反应体系在相同的条件下进行。封板时要注意抚平封板膜，避免产生气泡，影响荧光信号的检测。
 

　　3.放置样品：将密封好的96孔PCR板轻轻放入PCR仪的加热孔中，确保PCR板与仪器的接触良好，位置摆放正确。
 

　　4.设置程序：打开PCR仪的电源和配套的软件，根据实验要求设置热循环程序文件，包括预变性温度、时间，变性温度、时间，退火温度、时间，延伸温度、时间以及循环次数等参数。同时，设置反应板文件，对各孔进行标注，以便区分不同的样品。